Mgr inż. Weronika Wacławczyk – II rok studiów



Synteza nieracemicznych feromonów owadów i analiza ich inaktywacji enzymatycznej

Promotor: dr hab. Hubert Wojtasek, prof. UO

Słowa kluczowe projektu: feromony owadów, synteza asymetryczna, inaktywacja enzymatyczna


Cele projektu

Stały, silny nacisk selekcyjny środków chemicznych stosowanych przeciwko szkodnikom upraw powoduje występowanie odporności na wiele substancji aktywnych. Przyczynia się to do wprowadzania coraz większych ilości toksycznych substancji do środowiska i powoduje zwiększenie kosztów ochrony roślin uprawnych. Oprócz tego, związki chemiczne stosowane wobec owadów szkodliwych często są trujące również dla innych, pożytecznych gatunków. W związku z tym poszukuje się nowych metod kontroli szkodników. Nadzieją na ograniczenie stosowania, lub może kiedyś zastąpienie insektycydów tradycyjnych, są pułapki feromonowe. Stosowane są one do zwabienia owadów szkodliwych w jedno miejsce i następnie ich zabicie w bardzo ograniczonej przestrzeni w sposób mechaniczny lub chemiczny.

Duża część związków pełniących rolę feromonów zawiera centra chiralne i zwykle te właśnie atomy warunkują ich aktywność biologiczną. Bardzo często nawet minimalna zawartość przeciwnego stereoizomeru powoduje brak aktywności feromonu. Wymusza to opracowanie stereoselektywnych metod syntezy tych związków. Feromonami zawierającymi centra asymetrii są między innymi feromon agregacyjny stonki ziemniaczanej (Leptinotarsa decemlineata) – (S)-3,7-dimetylo-2-okso-6-okteno-1,3-diol, i feromon płciowy brudnicy nieparki (Lymantria dispar) – (7R,8S)-7,8-epoksy-2-metylooktadekan ((+)-disparlur) (Rys. 1). Gatunki te należą do jednych z najważniejszych szkodników w Polsce – stonka ziemniaczana głównie ziemniaka, a brudnica nieparka drzew liściastych – owocowych, parkowych i leśnych.

Rys. 1. Struktury (+)-disparluru – feromonu płciowego brudnicy nieparki, i (S)-3,7-dimetylo-2-okso-6-okteno-1,3-diolu – feromonu agregacyjnego stonki ziemniaczanej.


Celem projektu jest opracowanie nowych metod syntezy tych dwóch związków a następnie użycie ich do zbadania ich rozkładu enzymatycznego w czułkach owadów. W przypadku (+)-disparluru wykryto już reakcję prowadzącą do jego inaktywacji – jest to hydroliza ugrupowania epoksydowego do diolu. Jednak hydrolaza epoksydowa – enzym katalizujący tę reakcję, nie została do tej pory zidentyfikowana i wyizolowana. W projekcie planowane jest sklonowanie cDNA kodującego ten enzym i ekspresja białka rekombinowanego. Dla feromonu agregacyjnego stonki ziemniaczanej ścieżka rozkładu nie jest dotychczas znana i konieczne jest ustalenie, jakie reakcje są zaangażowane w ten proces.


Planowane metody i narzędzia badawcze:

Feromon stonki ziemniaczanej został odkryty w roku 2002 [1] i opracowane już zostały dwie stereoselektywne metody jego syntezy. W pierwszej zastosowano jako substrat (S)-linalool [2], który jednak jest niedostępny komercyjnie i trzeba go izolować z olejku oleandrowego, co znacznie zwiększa koszty i wyklucza syntezę na większą skalę. W drugiej z metod syntezy tego feromonu wykorzystano mieszaninę racemiczną 2,3-epoksynerolu, którą następnie stereoselektywnie acylowano za pomocą lipazy z Pseudomonas cepocia. Niestety, wydajność reakcji wyniosła tylko 16% [3]. Konieczne jest więc opracowanie taniej metody, która pozwoliłaby na syntezę tego związku na dużą skalę.

W projekcie przewiduje się opracowanie takiej metody wychodzącej od kwasu askorbinowego lub sorbitolu – tanich związków naturalnych. Feromon ten zostanie następnie wykorzystany jako substrat do reakcji enzymatycznych z ekstraktami czułków samców i samic stonki ziemniaczanej. Produkty degradacji będą analizowane za pomocą chromatografu gazowego z detektorem masowym. Na podstawie zidentyfikowanych produktów najprawdopodobniej będzie możliwa identyfikacja enzymu(ów) zaangażowanych w ten proces.

Feromon brudnicy nieparki, odkryty prawie 40 lat temu [4], był pierwszym feromonem zawierającym ugrupowanie epoksydowe. Opracowano kilka metod jego syntezy, w tym syntezę związku znakowanego trytem [5-7]. Po inkubacji znakowanego izotopowo feromonu z ekstraktem czułków stwierdzono hydrolizę ugrupowania epoksydowego do diolu [5]. Do tej pory u owadów zidentyfikowano i wyizolowano tylko jeden enzym katalizujący taką reakcję – hydrolazę epoksydową hormonów juwenilnych [8, 9]. Homologiczne enzymy zidentyfikowano u kilku gatunków. Posiadają one silnie zachowane sekwencje aminokwasowe centrum aktywnego, co pozwala przewidywać, że zastosowanie kodujących je oligonukleotydów w reakcjach PCR z matrycą cDNA z czułków samców brudnicy nieparki pozwoli na sklonowanie hydrolazy epoksydowej hydrolizującej (+)-disparlur. Enzym zostanie następnie wyprodukowany w formie zrekombinowanej a zsyntezowany w formie znakowanej izotopowo feromon zostanie użyty do potwierdzenia jego specyficzności substratowej.


Innowacyjność oraz przydatność dla rozwoju regionu:

Opolszczyzna jest regionem rolniczym o wysokiej kulturze rolnej z dobrze rozwiniętym przemysłem przetwórstwa spożywczego. Duży procent areału zajmuje uprawa ziemniaka oraz sady. Wydaje się, że opracowanie nowych, alternatywnych wobec tradycyjnych insektycydów i ekologicznych metod zwalczania dwóch ważnych szkodników upraw może przynieść poważne korzyści gospodarcze dla regionu. W świetle propagowanych obecnie w Europie bezpiecznych dla człowieka i środowiska technologii, zarówno w przemyśle jak i rolnictwie, oraz rosnących wymagań dotyczących zawartości pestycydów w środków spożywczych, wprowadzenie selektywnych, nietoksycznych metod ochrony roślin powinno być traktowane priorytetowo. Metody te mogą znaleźć zastosowanie szczególnie na obszarach chronionych oraz w rolnictwie ekologicznym. Znajomość enzymów zaangażowanych w procesy degradacji feromonów, poza walorem poznawczym, pozwala także na zaprojektowanie inhibitorów, które hamując rozkład feromonów zaburzają system komunikacji chemicznej owadów [10]. Pozwala to pracować całkowicie nowe techniki ochrony roślin, ponieważ same feromony z natury są wiązkami nietrwałymi i podatnymi na rozkład pod wpływem czynników środowiska.


Literatura:

[1] J. C. Dickens, J. E. Oliver, B. Hollister, J. C. Davis, J. A. Klun (2002) Breaking a paradigm: Male-produced aggregation pheromone for the Colorado potato beetle. J. Exp. Biol., 205(13), 1925-1933.

[2] J. E. Oliver, J. C. Dickens, T. E. Glass (2002) (S)-3,7-Dimethyl-2-oxo-6-octene-1,3-diol: an aggregation pheromone of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say). Tetrahedron Lett., 43, 2641-2643.

[3] T. Tashiro, K. Mori (2005) Enzyme-assisted synthesis of (S)-1,2-dihydroxy-3,7-dimethyl-6-octen-2-one, the male-produced aggregation pheromone of the Colorado potato beetle, and its (R)-enantiomer. Tetrahedron: Asymm., 16, 1801-1806

[4] B. A. Bierl, M. Beroza, C. W. Collier (1970) Potent sex attractant of the gypsy moth: its isolation, identification, and synthesis. Science, 170(953), 87-9.

[5] G. D. Prestwich, S. M. Graham, J.-W. Kuo, R. G. Vogt (1989) Tritium-Labeled Enantiomers of Disparlure. Synthesis and in Vitro Metabolism. J. Am. Chem. Soc., 111, 636-642.

[6] S. H. S. Jayaraman, A. C. Oehlschlager (1999) An efficient enentioselective synthesis of (+)-Disparlur. J. Org. Chem., 64, 3719-3721.

[7] J. A. H. Inkster, I. Ling, N. S. Honson, L. Jacquet, R. Gries, E. Plettner (2005) Synthesis of disparlure, using resolution on microcrystalline cellulose triacetate-I. Tetrahedron: Asymm., 16, 3773-3784.

[8] K. Touhara, G. D. Prestwich, (1993) Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase: Photoaffinity Labeling, Purification and Characterization from Tobacco Hornworm Eggs. J. Biol. Chem., 268, 19604-19609.

[9] H. Wojtasek, G. D. Prestwich (1996) An Insect Juvenile Hormone-Specific Epoxide Hydrolase Is Related to Vertebrate Microsomal Epoxide Hydrolases, Biochem. Biophys. Res. Commun., 220, 323-329.

[10] M. Maïbèche-Coisne, A. A. Nikonov, Y. Ishida, E. Jacquin-Joly, W.S. Leal (2004) Pheromone anosmia in a scarab beetle induced by in vivo inhibition of a pheromone-degrading enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101(31), 11459-64.





dol